การระบุยีนพิษจากทรานสคริปโตม

• ตัดขนพิษและต่อมพิษของหนอนระยะก่อนเข้าดักแด้ โดยใช้มีดผ่าตัด
• สกัด RNA จากเนื้อเยื่อด้วยชุดสกัด วัดปริมาณและคุณภาพของ RNA
• ส่งตัวอย่าง RNA ที่สกัดได้ ไปที่ศูนย์รับบริการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ (RNA-sequencing)
  • สร้าง cDNA จาก RNA แล้วทำ high throughput sequencing โดยใช้ Illumina HiSeq4000 platform

แบบ pair-end reads ความยาว 100 bp)

• วิเคราะห์ข้อมูลด้วยวิธีทางชีวสารสนเทศศาสตร์
  • Assembly: เชื่อมต่อ DNA สายสั้นๆที่เครื่องมือวิเคราะห์ได้ ที่เป็นชิ้นส่วนของยีนเดียวกันให้เป็น DNA สายยาว (Unigene) ด้วยโปรแกรม Trinity
  • Annotation: ทำนายหน้าที่ของแต่ละ Unigene โดยใช้โปรแกรม BLAST2GO
  • ระบุยีนสร้างโปรตีนพิษชุดแรกจาก keywords
  • สร้างฐานข้อมูลทรานสคริปโตมของหนอน Parasa lepida ด้วยโปรแกรม NCBI Blast 2.7.1+
  • แล้วนำโปรตีนพิษชุดแรกที่ระบุได้ มาทำการ BLAST ค้นหาโปรตีนพิษเพิ่มเติมรวมกับชุดแรก เป็นโปรตีนพิษชุดที่สอง
  • สร้างฐานข้อมูลโปรตีน 2 ชุด ด้วยโปรแกรม NCBI Blast 2.7.1+
    • ชุดที่ 1 โปรตีนพิษที่เคยมีรายงานในสัตว์จากฐานข้อมูล Uniprot (13,124 โปรตีน)
    • ชุดที่ 2 โปรตีนทั้งหมด (สถานะ reviewed) จากฐานข้อมูล Uniprot (558,125 โปรตีน)

• • นำโปรตีนพิษของหนอน Parasa lepida ชุดที่สองที่ระบุได้มาค้นหาโปรตีนที่ใกล้เคียงกัน (BlastP) ในฐานข้อมูลชุดที่ 1 และ ชุดที่ 2
  • เปรียบเทียบคะแนนของแต่ละ Hits จากแต่ละ database เก็บโปรตีนพิษของหนอน Parasa lepdia ไว้ กรณีต่อไปนี้
    1. มีคะแนนความเหมือนสูงกว่าเมื่อเทียบกับโปรตีนในฐานข้อมูลชุดที่ 1 (โปรตีนพิษของสัตว์)
    2. มีคะแนนสูงกว่าในฐานข้อมูลชุดที่ 2 แต่สัตว์นั้นเป็นสัตว์มีพิษ

• • โปรตีนพิษของหนอน Parasa lepdia ที่ผ่านเกณฑ์ เป็นโปรตีนชุดที่ 3
  • นำโปรตีนของหนอน Parasa lepdia แต่ละวงศ์ย่อยมาทำ Alignment พิจารณาส่วน conserved ถ้าไม่มีตัดโปรตีนนั้นออกไป
  • โปรตีนที่เหลืออยู่คือโปรตีนพิษของหนอนผีเสื้อ Parasa lepida