เก็บตัวอย่าง

เก็บตัวอย่างหนอนจากสวนมะพร้าว อ. จะนะ จ. สงขลา

เลี้ยงหนอนในกล่องเลี้ยงผีเสื้อและให้อาหารเป็นใบมะพร้าวสด

การระบุยีนพิษจากทรานสคริปโตม

  • ตัดขนพิษและต่อมพิษของหนอนระยะก่อนเข้าดักแด้ โดยใช้มีดผ่าตัด
  • สกัด RNA จากเนื้อเยื่อด้วยชุดสกัด วัดปริมาณและคุณภาพของ RNA
  • ส่งตัวอย่าง RNA ที่สกัดได้ ไปที่ศูนย์รับบริการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ (RNA-sequencing)
    • สร้าง cDNA จาก RNA แล้วทำ high throughput sequencing โดยใช้ Illumina HiSeq4000 platform

แบบ pair-end reads ความยาว 100 bp)

  • วิเคราะห์ข้อมูลด้วยวิธีทางชีวสารสนเทศศาสตร์
    • Assembly: เชื่อมต่อ DNA สายสั้นๆที่เครื่องมือวิเคราะห์ได้ ที่เป็นชิ้นส่วนของยีนเดียวกันให้เป็น DNA สายยาว (Unigene) ด้วยโปรแกรม Trinity
    • Annotation: ทำนายหน้าที่ของแต่ละ Unigene โดยใช้โปรแกรม BLAST2GO
    • ระบุยีนสร้างโปรตีนพิษชุดแรกจาก keywords
    • สร้างฐานข้อมูลทรานสคริปโตมของหนอน Parasa lepida ด้วยโปรแกรม NCBI Blast 2.7.1+
    • แล้วนำโปรตีนพิษชุดแรกที่ระบุได้ มาทำการ BLAST ค้นหาโปรตีนพิษเพิ่มเติมรวมกับชุดแรก เป็นโปรตีนพิษชุดที่สอง
    • สร้างฐานข้อมูลโปรตีน 2 ชุด ด้วยโปรแกรม NCBI Blast 2.7.1+
      • ชุดที่ 1 โปรตีนพิษที่เคยมีรายงานในสัตว์จากฐานข้อมูล Uniprot (13,124 โปรตีน)
      • ชุดที่ 2 โปรตีนทั้งหมด (สถานะ reviewed) จากฐานข้อมูล Uniprot (558,125 โปรตีน)
    • นำโปรตีนพิษของหนอน Parasa lepida ชุดที่สองที่ระบุได้มาค้นหาโปรตีนที่ใกล้เคียงกัน (BlastP) ในฐานข้อมูลชุดที่ 1 และ ชุดที่ 2
    • เปรียบเทียบคะแนนของแต่ละ Hits จากแต่ละ database เก็บโปรตีนพิษของหนอน Parasa lepdia ไว้ กรณีต่อไปนี้
      1. มีคะแนนความเหมือนสูงกว่าเมื่อเทียบกับโปรตีนในฐานข้อมูลชุดที่ 1 (โปรตีนพิษของสัตว์)
      2. มีคะแนนสูงกว่าในฐานข้อมูลชุดที่ 2 แต่สัตว์นั้นเป็นสัตว์มีพิษ
    • โปรตีนพิษของหนอน Parasa lepdia ที่ผ่านเกณฑ์ เป็นโปรตีนชุดที่ 3
    • นำโปรตีนของหนอน Parasa lepdia แต่ละวงศ์ย่อยมาทำ Alignment พิจารณาส่วน conserved ถ้าไม่มีตัดโปรตีนนั้นออกไป
    • โปรตีนที่เหลืออยู่คือโปรตีนพิษของหนอนผีเสื้อ Parasa lepida

ภาพประกอบ 2.1 ภาพรวมขั้นตอนการระบุยีนสร้างพิษของหนอนผีเสื้อ